El colegio se inaugura el 7 de febrero de 1841 como establecimiento particular dedicado a la enseñanza primaria, ocupando el recién refaccionado local del Estanco de Tabaco cedido por el gobierno, ubicado en la calle de la Chacarilla, en las inmediaciones del actual Parque Universitario y detrás del actual Edificio Alzamora Valdez, local de los organismos judiciales de Lima (el mismo que entre las décadas de 1950 y 1990 fuera sede del Ministerio de Educación).

Como vicerrector fue contratado el señor Ramón Azcarate, un distinguido marino español, y como capellán iba el padre fray Juan Vargas. Fue por iniciativa de este último que el colegio adoptó el nombre de Nuestra Señora de Guadalupe. Inicialmente se dictaron las siguientes clases: Gramática Castellana, Geografía y Matemáticas, a cargo de Azcarate; Religión, por fray Juan Vargas; primeras letras y francés por el profesor Blanco Batlles; dibujo, por Ignacio Merino; y música, por Mateo Rosas y Miguel Távara. El número de alumnos llegaba a 40.

En 1842 Domingo Elías contrata los servicios del español liberal Sebastián Lorente como rector del plantel. La presencia de Lorente significó la elevación de la calidad de la enseñanza convirtiéndose el colegio Guadalupe en un centro de instrucción media superior y, además, en el antagonista ideológico del Convictorio de San Carlos, baluarte del conservadurismo, cuyo rector era el célebre religioso Bartolomé Herrera.

A Sebastián Lorente le suceden los hermanos Gálvez (José y Pedro Gálvez Egúsquiza), ex alumnos del Convictorio de San Carlos. La rivalidad académica, ideológica y política entre estos colegios (el Guadalupe partidario del liberalismo y el San Carlos defensor del conservadurismo) y sus representantes persiste hasta 1852, año en que el Colegio Guadalupe es clausurado por el presidente José Rufino Echenique.